MitoStatus TMRE – 564696
MitoStatus TMRE – 564696
Descrição
Marca: BD Pharmingen ™
Aplicação: Bioimagem, imunofluorescência, citometria de fluxo (testado durante o desenvolvimento).
DESCRIÇÃO
Em células que sofrem apoptose, estresse oxidativo, necrose e outros processos celulares, o potencial de membrana mitocondrial (ψψm) pode se tornar despolarizado. Por exemplo, em células que sofrem apoptose, as proteínas pró-apoptóticas da família Bcl-2 causam permeabilização da membrana externa mitocondrial (MOMP), resultando na liberação do citocromo C e subsequente ativação da caspase-9 e da cascata apoptótica. O MOMP frequentemente se correlaciona com a perda do potencial de membrana mitocondrial interna (Δψm), que pode ser detectado usando corantes sensíveis a Δm. Esses corantes lipofílicos catiônicos se acumulam dentro das mitocôndrias de células saudáveis, mas não dentro das mitocôndrias que perderam Δm devido à indução de apoptose ou tratamento com um desacoplador mitocondrial.
BD Pharmingen ™ O MitoStatus TMRE (éster etílico de tetrametil-rodamina) é um corante fluorescente que é prontamente sequestrado por mitocôndrias ativas, permitindo a análise de citometria de fluxo ou de imagens para avaliar a apoptose ou a despolarização mitocondrial. As células não apoptóticas ou com mitocôndrias polarizadas irão brilhar em vermelho enquanto apoptóticas ou as células com mitocôndrias de despolarizes terão níveis diminuídos de fluorescência vermelha. O MitoStatus TMRE (éster etílico de tetrametil-rodamina) tem um máximo de excitação de 549 nm, mas está bem excitado pelos lasers azul (por exemplo, 488 nM) e verde-amarelo (por exemplo, 561 nM). Tem um máximo de emissão de 574 nm.
PRODUTOS COMPLEMENTARES SUGERIDOS
Gato não. | Descrição | Tamanho | |
---|---|---|---|
556454 | Tampão de Ligação da Anexina V, 10X concentrado RUO | 50 mL | |
561527 | Solução de Destacamento Celular Accutase ™ RUO | 100 mL | |
554656 | Tampão de mancha (FBS) RUO | 500 mL | |
550475 | APC Annexin V RUO | 200 testes | |
559925 | 7-AAD RUO | 2 mL | |
564061 | Calcein AM RUO | 1 mg | |
564060 | Calcein Blue AM RUO | 1 mg |
RECURSOS E FERRAMENTAS
AVISOS DO PRODUTO
- Como as aplicações variam, cada pesquisador deve titular o reagente para obter os melhores resultados.
- Para espectros de fluorocromo e configurações de instrumento adequadas, consulte a página da web Multicolor Flow Cytometry em www.bdbiosciences.com/colors.
- Accutase é uma marca registrada da Innovative Cell Technologies, Inc.
- Cy é uma marca comercial da GE Healthcare.
- Antes da coloração com este reagente, confirme se o seu citômetro de fluxo é capaz de estimular o fluorocromo e discriminar a fluorescência resultante.
- Por favor, consulte www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols para protocolos técnicos.
Armazenamento de corante
Na chegada, armazenar o corante em pó dessecado e protegido da luz a ≤ -20 ° C até o uso. O corante em pó é estável por pelo menos 12 meses, se armazenado conforme indicado. Após a reconstituição com DMSO, armazene a solução estoque em ≤ -20 ° C em pequenas alíquotas. A solução estoque é estável por pelo menos 6 meses, se armazenada conforme indicado.
Requisitos de citometria de fluxo
Antes da coloração com este reagente, confirme se o seu citômetro de fluxo é capaz de estimular o fluorocromo e discriminar a fluorescência resultante. Os citômetros de fluxo (por exemplo, BD FACSCanto ™ II, BD LSRFortess ™, BD ™ LSR II ou BD Accuri ™ C6) equipados com um laser azul (por exemplo, 488 nm) ou amarelo-verde (por exemplo, 561 nm) podem ser usados. A fluorescência do corante TMRE pode ser detectada com filtros comumente usados para ficoeritrina (PE) (por exemplo, 575/26 ou 582/15 nm).
A compensação de fluorescência é melhor obtida usando as amostras de células de interesse. Ao projetar painéis multicoloridos de coloração fluorescente, por favor, esteja atento ao transbordamento de alta fluorescência nos seguintes detectores de fluorocromos: BD Horizon ™ PE-CF594, BV605, BV650 ou PerCP-Cy ™ 5.5. Recomendamos a titulação do corante e usando a menor concentração que fornece resolução adequada de populações de células polarizadas e despolarizadas para reduzir o transbordamento de fluorescência.
Procedimento
BD Pharmingen ™ MitoStatus Rotulagem TMRE de células suspensas para análise por citometria de fluxo
1. Conte as células para determinar a densidade celular. Ajuste a densidade celular para 1 × 10 ^ 6 células / mL ou menos em meio de cultura celular fresco pré-aquecido.
2. Células coradas em meio de cultura celular fresco pré-aquecido ou tampão de mancha desejado com 20-200 nM de BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE em um recipiente de polipropileno adicionando a solução estoque diretamente às células na concentração desejada.
uma. Nota: BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE também pode ser adicionado diretamente à cultura, em vez de coloração em meio fresco. A colora�o pode tamb� ser realizada em tamp� de mancha BD Pharmingen� (FBS) pr�aquecido (Cat. N� 554656) ou PBS pr�aquecido. O PBS pode fornecer resolução aumentada para alguns tipos de células, mas também pode resultar em aumento da coloração de fundo.
b. Nota: Sabe-se que o TMRE adere ao poliestireno. As amostras devem ser coradas em recipientes de polipropileno.
c. Nota: Para auxiliar no gotejamento citométrico de fluxo, recomendamos o uso de células controle tratadas somente com veículo e / ou células tratadas com um desacoplador mitocondrial, como FCCP [Carbonilcianeto 4- (trifluorometoxi) fenilidrazona, por exemplo, Sigma Cat. C2920].
3. Incube as amostras por 15 a 30 minutos a 37 ° C, protegido da luz.
4. Lave as células duas vezes com BD Pharmingen ™ Stain Buffer (FBS).
5. Decantar o sobrenadante e misture suavemente para romper o pellet celular.
6. Ressuspender as células em tampão de coloração (FBS).
7. Analise as células por citometria de fluxo. Alternativamente, contraia as células com corantes fluorescentes compatíveis ou anticorpos conforme desejado e depois analise.
BD Pharmingen ™ MitoStatus Rotulagem TMRE de células aderentes para análise por citometria de fluxo.
1. As células aderentes devem ser coradas in situ com ≤ 70% de confluência. Células coradas em meio de cultura celular fresco pré-aquecido ou tampão corante desejado com 20-200 nM de BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE adicionando a solução mãe diretamente às células na concentração desejada.
uma. Nota: BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE também pode ser adicionado diretamente à cultura, em vez de coloração em meio fresco. A coloração também pode ser realizada em tampão de coloração BD Pharmingen ™ (FBS) pré-aquecido ou PBS de Dulbecco pré-aquecido (DPBS). O DPBS pode fornecer resolução aumentada para alguns tipos de células, mas também pode resultar em aumento da coloração de fundo.
b. Nota: Para auxiliar no gotejamento citométrico de fluxo, recomendamos o uso de células de controle tratadas somente com veículo e / ou células tratadas com um desacoplador mitocondrial, como o FCCP.
2. Incube as amostras por 15 a 30 minutos a 37 ° C, protegido da luz.
3. Lave as células duas vezes com BD Pharmingen ™ Stain Buffer (FBS).
4. Remova as células do meio de crescimento. Recomendamos o uso da Solução de Destacamento Celular BD ™ Accutase ™ (Cat. No. 561527).
5. Lave as células duas vezes com BD Pharmingen ™ Stain Buffer (FBS) ou equivalente.
6. Decantar o sobrenadante e misture suavemente para romper o pellet celular.
7. Ressuspender as células em tampão de coloração (FBS).
8. Analise as células por citometria de fluxo. Alternativamente, contraia as células com corantes fluorescentes compatíveis ou anticorpos conforme desejado e depois analise.
Notas:
1. Este corante não é compatível com a fixação celular.
2. Cada usuário deve determinar as concentrações ótimas de reagentes, células e condições para o ensaio de interesse. Recomendamos a titulação do reagente nas primeiras experiências para obter os melhores resultados.
3. As células podem ser coradas a granel antes da coloração com anticorpos fluorescentes.
BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE rotulagem de células para imagiologia fluorescente
1. Células coradas em meio fresco pré-aquecido com 20-200 nM BD Pharmingen ™ MitoStatus TMRE.
2. Incube as amostras por 15 a 30 minutos a 37 ° C, protegido da luz.
3. Remova a solução de coloração e substitua por DPBS pré-aquecido.
4. Analise as células por imagiologia de fluorescência. Alternativamente, contraia as células com corantes fluorescentes compatíveis ou anticorpos conforme desejado e depois analise.
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